Grazie alle cellule embrionali (ES) di
topo è stato possibile studiatre transgeni a tappeto, utili anche
per comprendere il modello umano.
Con micropipette viene inserito il costrutto con il transgene, il quale
si inserirà casualmente nel genoma murino.
Per avere topi mutanti per un certo gene si può partire producendo
un costrutto con 2 marcatori di selezione, ad esempio uno che conferisca
resistenza alla neomicina (G-418) e uno che conferisca sensibilità
al ganciclovirus (se presente porta la cellula a morte in presenza di
ganciclovirus). Per favorire una ricombinazione sito specifica occorre infine mettere
due sequenze omologhe a quelle esterne del gene di interesse ai lati del
gene per la resistenza a G-418 (lasciando esterno quello per la sensibilità
al ganciclovirus). Una volta inserito il costrutto nella nostra cellula
si hanno due diverse possibilità di integrazione: una, molto frequente,che
avviene in un punto casuale del genoma e una, piuttosto rara, in corrispondenza
del gene da inattivare. Somministrando G-418 vengono eliminate tutte le
cellule che non hanno integrato il costrutto. Poichè il gene per
la sensibilità al ganciclovirus è stato posto esternamente
rispetto alle sequenze di riconoscimento del gene da studiare, questo
verrà incorporato soltanto nelle cellule che hanno ricombinato
in maniera casuale, quindi basterà utilizzare il virus per selezionare
le cellule che hanno subito ricombinazione omologa.
Un altro possibile approcio per creare topi cnockout per un determinato
gene è l'utilizzo di un dominante negativo, ossia un gene che
quando espresso maschera l'effetto del rispettivo gene wt. Il
dominante negativo per agire efficacemente non necessita dunque di una
ricombinazione sito-specifica, basta che si integri in maniera casuale
e che venga espresso.
Una volta ottenute le cellule ES con il transgene, queste vengono iniettate
nel blastocele del topo, dove si mescoleranno alle cellule normali portando
alla formazione di un ibrido. Un buon sistema per distinguere fenotipicamente i topi che hanno
accettato le cellule trangeniche è l'utilizzo di 2 ceppi cellulari
di topi con colore del manto differente, le chimere risulteranno infatti
striate. Supponiamo di avere i topi wt con manto nero e i topi
transgenici con manto bruno, una volta individuate le chimere (con manto
striato), queste verranno fatte incrociare con topi recessivi (neri) fino
ad ottenere topi con manto completamente bruno. Ciò avviene quando
le cellule di interesse entrano a far parte della linea germinale del
topo, a questo punto avremo ottenuto un topo con tutte le cellule del
corpo eterozigoti per il nostro transgene. Il passo successivo è
quello di incrociare tra di loro i topi bruni per ottenere omozigoti. La prole seguirà la classica distribuzione mendeliana,
quindi si tratterà soltanto di selezianare i topi giusti.
Dagli omozigoti si capirà se il gene che stiamo studiando è fondamentale
per la sopravvivenza oppure no.