BIOLOGIA MOLECOLARE DELL'EMOSTASI


Costrutto distruttivo nel lievito

 


Lo studio del lievito è stato importantissimo per comprendere la funzione di numerosi geni umani. Un approcio sperimentale molto utilizzato è quello che prevede un costrutto distruttivo in grado di inattivare in maniera specifica un certo gene. Questo metodo consiste nel preparare un costrutto avente le estremità con la medesima sequenza del gene che si desidera inattivare, per permettere la ricombinazione omologa, e al centro un gene per la resistenza ad un antibiotico, che servirà a selezionare i lieviti che effettivamente hanno ricombinato. Essendo il lievito molto permissivo, basta aggiungere il nostro costrutto nel mezzo di coltura, che questo verrà tranquillamente inglobato dal lievito, il quale potrà quindi fare avvenire una ricombinazione omologa per riconoscimento delle sequenze esterne al gene studiato. Aggiungendo antibiotico verranno eliminati tutti i lieviti che non anno ricombinato e inducendo la sporulazione dei lieviti soppravvissuti si otterranno cellule aploidi, che saranno circa per un 50% ricombinanti e circa per un 50% wt. A questo punto basta quantificare il numero di lieviti che sopravvivono per capire se il gene che è stato inattivato è indispensabile per la vita oppure no (se sopravvive il 50%, il gene è fondamentale, mentre se sopravvive il 100% il gene non è indispensabile perchè il lievito può vivere anche senza di lui).
Si è constatato che dei 6.000 geni del lievito sottoposti a questo esperimento, soltanto 1/3 di essi non ha mostrato un fenotipo alterato, probabilmente perchè quando un gene viene inattivato, altri geni possono compensare la sua perdita oppure alcuni geni potrebbero essere utili per la sopravvivenza in condizioni estreme, mentre in laboratorio si utilizzano soltanto condizioni ottimali.

 



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