Oggi è possibile creare librerie di oligopeptidi generati
in maniera casuale per valutarne l'interazione con altre proteine. La tecnica
più utilizzata è la "Phage Display".
Il fago esprime proteine che vengono esposte in superficie (es. p1 e p2).
Il phage display consiste nell'ingegnerizzare questi fagi facendo loro esprimere
proteine di fusione che verranno localizzate all'esterno del coat
virale. Creando quindi delle chimere in cui una porzione della proteina è
rappresentata dalla proteina del fago e la restante porzione è il nostro
peptide di interesse. è sufficiente eliminare il codone di stop dalla
orf della proteina fagica e sostituirla con la sequenza codificante per il
nostro peptide.
Siccome viene creata una proteina di fusione, non si può avere l'assoluta
certezza che il suo comportamento rispecchi esattamente quello della proteina
libera, per avere un'ulteriore conferma si potrebbe provare a fonderla con
due diverse proteine di superficie del fago (es. prima con p1 e poi con p2).
L'ingegnerizzazione del fago può essere fatta con peptidi naturali,
con peptidi sintetici, con domini proteici, con proteine intere o con le regioni
variabili degli anticorpi.
Il punto di partenza per il phage display non è la proteina, ma l'acido nucleico.
Per costruire una libreria di peptidi bisogna generare una popolazione di
sequenze di DNA. Se questa sequenza è corta, creare una libreria è
semplicissimo, come creare gli oligonucleotidi per un microarray. Alla fine
ogni fago esporrà un solo tipo di proteina, quindi ogni fago sarà
diverso da tutti gli altri.
Una volta creata la libreria peptidica,
il passo successivo è quello di eseguire uno screening per analizare
ogni peptide. Si può utilizzare una cromatografia per affinità :
la miscela contenente i fagi viene purificata mediante interazione con
un unico tipo di proteina (es. un recettore), viene fatta eluire attraverso
una colonna in cui è stata legata covalentemente la proteina di
interesse, più le interazioni col peptide esposto da fago sono
forti e più questo verrà trattenuto. Le interazioni proteina-proteina
dipendono dal pH e dalla forza ionica del tampone utilizzato, quindi occorrerà
riprodurre le condizioni il più vicino possibile a quelle fisiologiche.
La fase di screening non viene fatta una singola volta, ma è ripetuta
per diversi cicli (6-8 volte) per ridurre la probabilità di considerare
legami aspecifici. Ogni eluizione, inoltre, è seguita da un ciclo
di infezione in batteri, in maniera tale da ottenere un'amplificazione
naturale dei peptidi isolati dalla cromatografia. Nell'ultimo ciclo di
eluizione, anzichè far crescere i vurus isolati in terreno liquido,
li si coltiva su piastra per potere selezionare i vari cloni con lo scopo
individuare i singoli peptidi che hanno interagito con la nostra proteina.
Una volta isolati i fagi che interagiscono con la proteina di studio si
procede con la misurazione della costante di affinità che hanno
per essa, poi il passo successivo è determinare l'attività
biologica di ogni peptide.
Comparando le sequenze dei peptidi che hanno maggiore affinità
con la proteina, si possono individuare gli aminoacidi indispensabili
per quests interazione, da questi si può poi partire per fare una
seconda libreria più mirata, nella quale si varieranno solo gli
aminoacidi non necessari per l'interazione lasciando fissi quelli indispensabili.
Nel phage display è importante ottimizzare la dimensione delle sequenze proteiche
del costrutto, non devono distruggere il coat del virus, ma nello
stesso tempo devono essere qualitativamente utili, inoltre bisogna tener
conto del fatto che si potrebbe verificare una sottoespressione della
proteina.
Esiste una variante del phage display che sfrutta il sistema helper
: in questo sistema nel nostro fago ci sono soltanto le sequenze per i
peptidi di studio, mentre le proteine necessarie per l'assemblamento del
coat sono interamente fornite da un fago helper. Questo sistema ha un'alta
efficienza.
La phage display si può fare con il fago M13, un fago inizialmente
utilizzato per il sequenziamento, perchè produce un DNA a singolo
filamento. Esso presenta diversi tipi di proteine sul coat, in particolare
la pVIII, molto rapresentata sulla sua superficie. La pVIII viene altamente
polimerizzata per avvolgere il fago, quindi è ideale per testare
proteine di fusione.
Nella phage display si parla di "evoluzione convergente"
quando si trovano i peptidi che interagiscono con il nostro recettore
e si paragonanao al peptide naturale per determinare le zone di omologia,
mentre si parla di "evoluzione diretta" quando la sequenza
ottenuta dai primi stadi di selezione viene mutagenizzata punto alla volta
per vedere gli aminoacidi più importanti per l'interazione con
il recettore.
Altra variante della phage display è la Phage display antibody
library , tramite la quale si possono selezionare tramite anticorpi
proteine naturali aventi una determinata sequenza variabile e di queste
fare un successivo phage display. Oppure creare una libreria sintetica
contente i vari frammenti delle proteine isolate.