BIOLOGIA MOLECOLARE DELL'EMOSTASI


Complessi di sorveglianza del messagero

 

Dal punto di vista energetico è molto meno dispendioso produrre RNA non coreeto rispetto a proteine non corrette, quindi evolutivamente si è preferito produrre una maggior quantità di mRNA e basarsi su un controllo molto affidabile per eliminare quello errato, anzichè porre questo step a livello della traduzione proteica, così si evita anche il rischio della sintesi di proteine che potrebbero essere tossiche per la cellula.
Tra i complessi di sorveglianza del messaggero riveste una notevole importanza il "nonsense mdiated decay" (NMD).
Durante la maturazione del messaggero, a poca distanza dallo spliceosoma c'è un complesso EJC. è inoltre messa in evidenza una proteina che a causa di una mutazione ha un codone di stop prematuro (sequenza UAA). Nel messaggero in maturazione grazie alle EJC vengono reclutate proteine Upf (quelle umane sono chiamate hUpf), queste sono mediatori del NMD.
Quando arrivano le Upf, le EJC si allontanano. Se permanesse questa situazione arriverebbe l'ultimo membro della famiglia delle Upf: Upf1 che ha il compito di mediare una risposta NMD. A maturaione arriva il ribosoma che spiazza le proteine EJC con Upf2 e Upf3, quindi durante la traduzione rimuove tutti le EJC. Se c'è un codone di stop prematuro ad almeno una cinquantina di basi da quello reale la sequenza blocca il ribosoma per interazione con l'RF (releasing factor), quindi da quel punto in poi rimangono i complessi EJC perchè il ribosoma non era ancora arrivato a spiazzarli. A questo punto arriva Upf1, essenziale per evocare una risposta NMD, questo segnale porta a decapping e deadenilazione della coda poli-A rendendo il messaggero suscettibile alle ribonucleasi.
Ci sono evidenze sperimentali che negli eucarioti la prima lettura ribosomale del messaggero avviene nel nucleo invece che nel citoplasma e che già in questa sede avviene la risposta NMD.
La degradazione avviene per decapping, deadenilazione e ad opera di endonucleasi.
Quando si forma una doppia elica di RNA scattano meccanismi di degradazione, come ad esempio il sistema RISC.
Consideriamo la mutazione Ultrabitorax (Ubx) osservata in Drosophila. Esistono due isoforme dovute a splicin alternativo, una delle due: Ubx 190, presenta un codone di stop prematuro, quindi è in grado di suscitare una risposta NMD. Analizzando il frammento contenente la mutazione tramite restrizione si possono distinguere gli omozigoti dagli eterozigoti. In questo esperimento è stata eseguita una RT-PCR in cui si è amplificato il frammento di Ubx contenente il sito di splicing alternativo, inoltre sono state utilizzate due diverse sonde fluorescenti esattamente a metà del punto di splicing. In questo modo le due sonde si appaiavano selettivamente ad una o all'altra isoforma. Per finire si è analizzato il grafico della RT-PCR e si è visto che la curva dell'isoforma contenete il codone di stop prematuro partiva più tardi, a significare che c'era una minor quantità di templato di partenza perchè si è innescata una risposta NMD.
è stata studiata la localizzazione del sistema NMD marcando radioattivamente Upf1e osservandolo nello sviluppo di embrioni di Drosophila. La maggior quantità di Upf1 si riscontra nell'uovo appena fecondato, quindi è fornito da geni materni, poi cala via via che l'embrione si sviluppa. Sperimentalmente non è possibile creare cnockout di questo sistema perchè la mortalità è precocissima, a ribadire l'importanza di Upf1. Non è nemmeno possibile utilizzare l'inattivazione genica con RNA a doppia elica perchè Upf1 è coinvolto anche nel sistema degli RNAi.

 



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